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경의 시각화 연구는 주로 형광 조영제를 사용하여 신경을 추적하는 방법으로 이뤄지고 있다. Whitney[5]의 경우 마우스에서 형광 펩티드 NTQTLAKAPEHT(NP41)를 주사하여 모든 말초 신경이 2시간 내에 명확하게 묘사되는 것을 보여주었으며, Gibbs-Strauss[10]는 형광 조영제로 4,4’-[(2-methoxy-1,4-phenylene)di-(1E)-2,1-ethenediyl]bis-benzenamine(BMB)와 4-[(1E)-2-[4-[(1E)-2-[4-aminophenyl] ethenyl]-3-methoxyphenyl]ethenyl]-benzonitrile(GE3082)를 흰쥐와 돼지에 주사하여 신경과 다른 조직이 뚜렷하게 대비되는 것을 보여주었으나, 형광 조영제의 독성과 부작용 등 잠재적인 위험성으로 인해 현재까지 임상용으로 승인된 바 없을 뿐더러[11] 조영제 사용 준비시간, 비용, 용량 제약, 짧은 주기, 알레르기 반응 등 임상적용에 고려해야 되는 사항이 많다[12][13].

신경조직은 미세소관이 신경축삭의 길이 방향에 따라 평행하게 배치되는 특성으로 인해 이방성 구조를 가지고 있으며[16], 이는 빛과 강한 이방성 상호작용을 초래하여 광 조사에 의해 선형 편광된 빛 반사를 유도한다고 알려져 있다[17]-[19]. Chin[15]은 편광판과 회전 가능한 디스크가 있는 장치로 구성된 CPLi(Collimated Polarized Light imaging) 현미경을 이용하여 인간 사체 조직의 손에 분포된 신경을 검출하였으며, Cha[14]는 1개의 광학 카메라, 1개의 편광 카메라, 2개의 근적외선 카메라, 총 4개의 카메라와 병렬 컴퓨팅 이미지 처리를 통해 돼지와 쥐 모델에서 신경뿐만 아니라, 정맥 및 동맥을 식별하는 기술을 선보였다. 하지만 Chin이 소개한 기술은 편광판과 신경축삭의 길이 방향을 평행하게 배치하는데 시간이 걸리고, 2개 이상의 카메라를 이용한 방식의 경우, 영상의 불일치를 보정하기 위해 각 영상 간 픽셀의 비교가 필요하게 되어 복잡한 영상처리 알고리즘이 필요하게 된다.

액정은 전압에 따라 액정의 정렬 방향이 변하는 특성을 갖고 있으며, 이 특성을 사용하면 간단한 전압 제어만으로 0도와 90도 위상의 빛을 선택적으로 투과시킬 수 있다[20][21]. 그림 1에서는 LCPi 시스템의 원리를 설명하고자 하였으며, 그림 1(a)는 액정에 인가되는 전압에 따른 빛의 위상 변화를, 그림 1(b)는 LED(Light Emitting Diode)에서 발광된 비편광성 빛이 신경조직에서 편광성 빛으로 반사된 후 액정, 편광판, 이미지 센서 순으로 들어가는 과정을 도식화한 것이다. 액정을 사용함으로써, 하나의 CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor) 카메라만을 통해 다양한 각도의 편광 이미지를 획득할 수 있으며, 기구설계뿐만 아니라, 영상처리 알고리즘도 단순하게 구현할 수 있다.

Fig. 1. 
Conceptual view of LCPi system, (a) Phase change of light by the rotation of liquid crystal depending on the applied voltage, (b) Schematic of nerve visualization using LCPi system

시분할 LCPi 시스템의 구성은 크게 광학부과 영상처리 프로그램 두 부분으로 나누어져 있다. 광학부는 그림 2(a, b)와 같이 LED광원, 액정, 편광판, 제어보드(Control board)로 구성되며, 그림 2(c)와 같이 카메라(acA2500-60um, Basler)가 장착된 실체현미경(SMZ1270, Nikon)의 헤드에 장착 가능하다. 제어보드는 컴퓨터와 USB-to-RS232로 연결되어 제어신호를 주고받으며, LED 광원의 밝기 제어, 액정 전압 인가, 트리거 신호 발생의 역할을 한다. 트리거 신호는 액정에 전압을 인가하는 시간과 카메라 촬영 시간의 동기화를 위한 것으로 액정에 전압을 인가함과 동시에 펄스 신호로 발생되어 카메라의 입력으로 연결된다.

Fig. 2. 
LCPi system for nerve visualization. (a) Exploded view of the optical part, (b) Control board for LED illumination, liquid crystal control and triggering, (c) Optical part of LCPi system mounted on microscope, (d) Enlarged image of the optical part, (e) Bottom-view of the optical part

0도와 90도의 위상차를 갖는 영상을 시분할로 연속하여 카메라로 촬영하고, 이 영상은 컴퓨터와 USB3.0 규격으로 연결되어 초당 60 프레임으로 저장된다.

카메라로부터 획득한 컬러 영상은 회색조로 변환된 후 트리거 신호에 따라 얻어진 프레임 간의 차를 구한다. 그 후, 정해진 임계 값에 따라 영상을 이진화해 편광 영역에 대한 마스킹 영상을 구한다.

마스킹 영상은 원본 이미지 위에 겹쳐 보여진다. 그림 3에서는 획득된 영상에서 편광성을 보이는 영역을 검출하는 알고리즘을 도식화하였다. 그림 3의 우측 영상 1열은 편광성 물체에서 반사된 빛이 특정 방향의 빛을 주된 성분으로 갖는 특성을 보여준다. 예를 들어 물체에서 세로로 편광된 빛이 반사되었다고 가정하면, 가로 편광필터를 통과할 때는 빛의 크기가 작아지고, 세로 편광필터를 통과할 때는 빛의 크기가 유지된다. LCPi 시스템으로 촬영한 두 영상에서 밝기 부분의 변화만을 검출하기 위해 그레이 영상(2열)으로 변환한 뒤, 픽셀값의 차이를 이용하면 3열의 영상처럼 편광성 물체만을 분할할 수 있다.

Fig. 3. 
Flowchart of the image processing algorithm for identifying the nerve

영상처리 프로그램(Neuro vision)은 객체지향 언어인 C++로 개발되었으며, 사용자 인터페이스 구성은 그림 4와 같이 영상 표시부, 시스템 제어부, 카메라 제어부, LED 제어부로 되어 있다. 영상 표시부는 실시간 영상, 0도 방향의 정지영상(Snap 1), 90도 방향의 정지영상(Snap 2), 신경이 시각화된 결과영상(Draft)으로 구성되어 있다. 시스템 제어부는 차단주파수 값을 조절할 수 있는 저역통과 필터, 고역통과 필터, RGB 채널 별 영상 추출기능과 단계별 촬영 기능을 가지고 있다. 카메라 제어부는 노출, 화이트 밸런스, 이득 조절 기능을 가지고 있으며, LED 제어부는 조명 전원 및 밝기 조절기능을 가지고 있다.

Fig. 4. 
User interface configuration of the image processing program of the dual polarized light field imaging system for identifying the nerve

본 논문에서는 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐(약 270g)를 실험동물로 사용하였으며, 습도 55±5%, 온도 22±1℃, 12시간 간격으로 명암주기로 제어된 시설에서 표준사료와 물을 충분히 공급하면서 환경에 적응시켰다. 실험동물의 마취는 졸레틸(Zoletil)과 럼푼(Rompun)을 3:1로 혼합하여 근육 내 주사하여 마취시키고, 관류 없이 과잉 마취함으로써 희생시켰다. 실험동물 관리 및 처치와 관련된 모든 절차는 Woojung BSC, Inc. 동물실험윤리 위원회(승인 번호: WJIACUC 20130212-1-07)의 지침을 준수하여 수행하였다.

수술은 먼저 백서의 사지를 고정한 뒤 좌측 둔부와 대퇴부 후면을 면도기로 삭모하고 베타딘과 알콜로 소독한다. 삭모 된 피부의 약 3cm를 종 절개하고 외전 근(Abductor muscles)을 횡 방향으로 박리하여 둔근(Gluteus muscle)과 대퇴 이두근(Biceps femoris) 사이의 좌골 신경을 노출한다. 이후 백서를 LCPi 시스템이 장착된 실체현미경의 재물대 위에 위치하여 신경 시각화를 위한 장치로서의 타당성을 검증하였다.

실험동물을 통한 실험에 앞서, LCPi 시스템의 편광 검출 능력은 삼각형 모양의 편광필름을 실체현미경에 장착된 LCPi의 광학부로 촬영한 후 NeuroVision을 통해 검증하였다. 그림 5에서 볼 수 있듯, NeuroVision의 정지영상1과 정지영상2의 이미지 비교에서는 액정의 전압 인가 여부에 따라 편광필름 영역의 밝기 차이가 극명하게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 결과영상에서는 편광필름 영역만이 올바르게 형광으로 표시되는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 5. 
Triangular polarizing film images taken with the LCPi system, (a) Snap1 image in 0 degree direction, (b) Snap2 image in 90 degree direction, (c) Draft image showing fluorescent polarizing film through image processing algorithm

Bueno[22]는 광원의 파장에 따라 편광 검출 성능이 차이가 난다고 발표한 바 있다. 본 연구에서는 신경 검출에 최적화된 파장을 선정하기 위해 실험동물의 좌골신경에 해당되는 조직부위가 보이도록 편광판과 카메라를 설치한 후 400, 450, 500, 550, 600, 650nm의 파장을 순차적으로 조사하여 신경조직의 편광차이를 확인하였다.

그림 6에서 볼 수 있듯, 400nm와 650nm 파장의 경우 정지영상 간 편광차이가 거의 없으며, 500, 550, 600nm 파장의 경우 편광차이는 있으나, 신경조직과 주변조직 간 영역의 구분은 명확하지 않았다. 450nm 파장의 경우 신경조직의 편광차이가 뚜렷하여 주변조직과의 구분이 명확하였다.

Fig. 6. 
Polarization detection performance according to the wavelength of light source

LCPi 시스템의 신경검출 성능을 입증하기 위해 실험동물의 좌골신경에 해당되는 조직부위를 실제 촬영하여 영상화하였다. 그림 7에서 볼 수 있듯 LCPi 시스템을 통해 동일한 위치로 0도 방향의 위상 빛의 영상, 90도 방향의 위상 빛의 영상, 그리고 영상처리된 영상 획득이 가능하였으며, 영상처리 알고리즘을 통한 신경의 시각화 또한 가능한 것으로 판단되었다.

Fig. 7. 
Nerve images taken with the LCPi system. (a) Snap1 image in 0 degree direction, (b) Snap2 image in 90 degree direction, (c) Draft image showing fluorescent polarizing film through image processing algorithm